- Что не так с ПЦР тестами — снова?
- Форвард Праймер обеспечил обширные матчи на людях
- Обратный праймер также совпадал с человеческой ДНК на нескольких хромосомах
- Флуоресцентный детекторный зонд дал повторяющиеся точные совпадения с человеком
- Оригинальный патент TaqMan признаёт несовершенную комплементарность
- Итог
- Еще материалы по теме ПЦР
- Материалы по «хантавирусу»
В Израиле подтверждён первый случай хантавируса. Об этом информирует издание Jerusalem Post. Сообщается, что пациент – мужчина, который ранее предпринял поездку в Восточную Европу. Какую из стран региона он посетил, не сообщается.
Мужчина заболел через несколько месяцев после возвращения в Израиль. За помощью он обратился, когда почувствовал недомогание, характерное для этого заболевания. Наличие хантавируса в организме пациента подтверждено ПЦР-тестом, сказано в публикации.
Что не так с ПЦР тестами — снова?
Мы уже проходили с ПЦР на корь и на отшумевший месяцами ранее Нипах.
Анализ BLAST прямого праймера, обратного праймера и флуоресцентного зонда, использованных в опубликованном RT-qPCR-анализе хантавируса, выявил повторяющиеся точные совпадения с геномным материалом человека, что вызывает вопросы о том, могут ли человеческие нуклеиновые кислоты способствовать положительному генерированию ПЦР-сигналов хантавируса при некоторых условиях анализа.
BLAST расшифровывается как Basic Local Alignment Search Tool — широко используемый биоинформатический алгоритм для сравнения биологических последовательностей.
Проще говоря, части генетических последовательностей, используемых в ПЦР-тесте для якобы обнаружения хантавируса, также напрямую совпадают с последовательностями человеческой ДНК.
- Это означает, что компоненты тестирования не были исключительно уникальны для хантавируса на уровне последовательности.
- Положительные результаты могут указывать на наличие человеческого материала, а не вирусного.
Это разоблачение произошло на фоне тревоги в основных СМИ по поводу предполагаемой вспышки хантавируса на круизном лайнере у берегов Западной Африки.
Новые результаты BLAST становятся более значимыми в сочетании с оригинальным патентом США 5,210,015, который прямо указывает, что комплементарность ПЦР-зонда «не обязательно должна быть идеальной» и что обнаруживаемый сигнал может возникнуть через «полимеризационно-независимое расщепление», то есть обнаруживаемое генерирование флуоресцентного сигнала не обязательно требует полного усиления цели.
Проще говоря, оригинальный патент, лежащий в основе современного ПЦР-тестирования TaqMan, признаёт, что химия всё ещё может генерировать обнаруживаемый сигнал даже при несовершенном генетическом сопоставлении и даже когда полная амплификация целевой последовательности не происходит.
Даже частичное сходство между компонентами ПЦР хантавируса и генетикой человека может привести к положительному результату теста, даже если вирус отсутствует.
Анализируемые компоненты анализа включали:
- Вперёд грунтовка:
GCAGCTGTGTCTACATTGGAGAA - Обратная капсула:
TGGTTTTGAAGCCAGTTTTTGA - Последовательность зонда:
AAACTCGCAGAACTCAAGAGACAGCTGGC
Они были получены в результате исследования PLoS Neglected Tropical Diseases в декабре 2019 года.
Праймеры — это короткие генетические последовательности, предназначенные для связывания с целевой областью, чтобы начать амплификация.
Зонд — это компонент флуоресцентного обнаружения, который помогает генерировать «положительный» сигнал, видимый машиной.
Зондовая последовательность была получена из опубликованного анализа после удаления меток флуоресцентного репортера и гасителя ( и ), так что анализировался только сама нуклеотидная последовательность.FAMZEN
Форвард Праймер обеспечил обширные матчи на людях
Анализ переднего праймера BLAST дал множество точных и почти точных совпадений с геномным материалом человека.
Это означает, что части последовательности праймеров напрямую совпадали с последовательностями, которые уже естественно присутствуют в человеческом геноме.
Результаты включали:
- повторные точные совпадения 19/19,
- несколько точных совпадений 18/18,
- повторялись 17 из 17 точных совпадений
- и широкое количество матчей 16 из 16.
«Точное совпадение 19/19» означает 19 последовательных генетических букв, идеально совпадающих между запрашиваемой последовательностью и человеческой ДНК.
Последовательность совпадала с:
- Области, связанные с GALNT6,
- Области, связанные с EPHB2,
- Регионы, связанные с ZBTB20,
- Хромосома 1,
- Хромосома 3,
- Области усилителя,
- Библиотеки клонов BAC,
- и множество дополнительных геномных локусов.
Одно из маршрутов показало:
«Идентичности: 19/19(100%)»
Другой показал:
«Идентичности: 18/18(100%)»
Источник данных: https://jonfleetwood.substack.com/api/v1/file/ccd1a19f-aecd-4cbc-ae4e-cab60b7720bb.pdf
Обратный праймер также совпадал с человеческой ДНК на нескольких хромосомах
Обратный праймер дал аналогично обширные человеческие выравнивания.
Другими словами, обе стороны системы амплификации ПЦР показали значительное пересечение последовательностей с человеческим генетическим материалом.
Результаты включали:
- повторялись 20/20 точные совпадения,
- несколько точных совпадений 18/18,
- многочисленные точные совпадения 17/17,
- и широко распространённые совпадения 16/16.
«Точное совпадение 20/20» означает, что все 20 генетических букв идеально совпадают с человеческой ДНК.
Последовательность совпадала с:
- RBFOX1,
- KCNH5,
- TGFB2,
- DLG2,
- CDH13,
- ROBO2,
- PLA2G4A,
- MYO5C,
- Области с тяжёлой цепью иммуноглобулинов,
- а также многочисленные области человеческих хромосом, включая хромосомы 1, 3, 5, 8, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 21, X и Y.
Одно из направлений показало:
«Идентичности: 20/20(100%)»
Другие показали:
«Идентичности: 18/18(100%)»
и:
«Идентичности: 17/17(100%)»
Источник: https://jonfleetwood.substack.com/api/v1/file/2b49807e-09d1-4327-9618-2766786bffb9.pdf
Флуоресцентный детекторный зонд дал повторяющиеся точные совпадения с человеком
Самые показательные результаты были получены при анализе BLAST самого флуоресцентного зонда TaqMan — последовательности, непосредственно участвующей в химии обнаружения сигналов.
Это важно, потому что зонд отвечает за генерацию флуоресцентного сигнала, который машина ПЦР интерпретирует как «положительный».
Зонд произвел:
- повторялись 18/18 точных совпадений
- многочисленные точные совпадения 17/17,
- повторялись 16 из 16 точных совпадений
- и 20/21 (95%) совпадение с геномной ДНК человека.
Совпадение 20/21 означает, что 20 из 21 генетической буквы совпадают с человеческой ДНК.
Зонд выровнялся с:
- Хромосома 1,
- Хромосома 12,
- хромосома 18,
- хромосома 19,
- 21-я хромосома,
- TMEM192,
- Варианты транскрипта MGA,
- BCLAF3,
- SESN1,
- Участки энхансера OCT4-NANOG,
- а также несколько библиотек человеческой геномы BAC и FOSMID.
Одно из маршрутов показало:
«Идентичности: 18/18(100%)»
Другой показал:
«Идентичности: 17/17(100%)»
И ещё один показал:
«Идентичности: 20/21(95%)»
Источник таблиц: https://jonfleetwood.substack.com/api/v1/file/4992e7b0-5c04-440f-b018-a53899b0a7c8.pdf
Оригинальный патент TaqMan признаёт несовершенную комплементарность
В оригинальном патенте TaqMan PCR прямо говорится:
«Дополнение не обязательно должно быть идеальным; стабильные дуплексы могут содержать несовпадающие пары оснований или несовпадающие базы.»
Патент признаёт, что положительная химия, дающая положительный результат, может функционировать даже при несовершенном генетическом совпадении.
В патенте также говорится:
«В этом процессе полимеризация не нужна для того, чтобы нуклеиновая кислота-полимераза была в положении для достижения расщепления, поэтому мы называем это расщепление, независимое от полимеризации.»
Это означает, что обнаруживаемая химия сигнала может происходить даже без полного усиления целевой последовательности.
И:
«Таким образом, можно получить достаточное количество маркированных фрагментов, что позволяет их обнаружить при отсутствии полимеризации.»
То есть патент явно описывает ситуации, когда обнаруживаемый сигнал может возникнуть даже без полного процесса усиления, который обычно ассоциируют с ПЦР.
Патент также объясняет:
«Одним из преимуществ процесса, независимого от полимеризации, является устранение необходимости амплификации последовательности мишень.»
Обнаруженная генерация сигнала может происходить без полного усиления целевой генетической последовательности.
Итог
Результаты BLAST и формулировка патента показывают:
- передний праймер повторяет точные совпадения с человеческой ДНК,
- обратный праймер повторяет точные совпадения с человеческой ДНК,
- а сам флуоресцентный детектор повторяет точные совпадения с человеческой ДНК.
Все три основных компонента, участвующие в системе амплификации и обнаружения анализа, демонстрировали прямое пересечение последовательностей с человеческим генетическим материалом.
Тем временем оригинальный патент TaqMan прямо признаёт, что:
- Комплементарность «не обязательно должна быть идеальной»,
- Обнаруживаемый сигнал может возникать через «полимеризационно-независимое расщепление»,
- и обнаружение может происходить «при отсутствии полимеризации».
В совокупности результаты открывают возможность того, что сам генетический материал человека может с правдоподобной вероятностью способствовать положительному генерации ПЦР-сигналов хантавируса при некоторых условиях анализа.
Если праймеры и флуоресцентный детекторный зонд анализа существенно пересекаются с человеческим генетическим материалом, то так называемые «случаи» хантавируса могут представлять собой не что иное, как система ПЦР, обнаруживающая собственную генетику пациента, а не реальный вирус.
Напоминаем о натуральном средстве:
Еще материалы по теме ПЦР
- Корь обнаруживают с помощью ПЦР: но что показывает этот тест?
- Нипах определяют снова — с помощью ПЦР?
- Некорректность ПЦР диагностики снова доказана спустя 5 лет
- ПЦР мазок из носа признан «незаконным требованием» по решению суда
Материалы по «хантавирусу»
- «Хантавирус», генная терапия и переговоры ВОЗ
- Белок красных водорослей и снижение нагрузки нового «хантавируса»
